2023年10月2日，北京大学全军民教授团队联合中山大学卜宪章教授团队在 Nature  C ommunications 在线发表了题为“ Development of cyclopeptide inhibitors of cGAS targeting protein-DNA interaction and phase separation ”的研究论文，这项研究通过靶向P PI s（蛋白质-蛋白质相互作用）环肽库的体外筛选，鉴定出一类新型cGAS环肽抑制剂。联合团队通过分子模拟、体外生化实验以及细胞实验验证了该抑制剂靶向cGAS和dsDNA之间的蛋白质-DNA界面，破坏dsDNA和cGAS之间的相互作用，进一步抑制dsDNA诱导的cGAS液液相分离（LLPS）。同时，优化的类似物XQ2B在体外和体内抑制了单纯疱疹病毒-1（HSV-1）诱导的抗病毒免疫反应，并增强了HSV-1感染。此外，XQ2B显著抑制 Trex1 ^-/- 小鼠原代巨噬细胞中I型干扰素和促炎细胞因子水平的升高以及 Trex1 ^-/- 小鼠的全身炎症。这项工作为突破现有cGAS抑制剂临床应用的局限性提供了新的思路，也为自身免疫及自身炎症性疾病的治疗提供新的策略。

 

 

 

cGAS-STING信号通路是天然免疫系统的重要组成部分。cGAS作为异常胞浆DNA的重要传感器，在病原体入侵和细胞应激时被活化并进一步激活下游衔接蛋白STING（干扰素基因刺激因子），进而启动先天免疫反应。cGAS通过诱导干扰素刺激基因（ISG）的表达，在抗病毒反应和抗肿瘤免疫中发挥关键作用。相反，cGAS-STING通路的异常激活已被证明是自身免疫性和自身炎症性疾病的关键发病机制。TREX1是负责降解胞质DNA的核酸外切酶，其功能缺失突变导致胞质dsDNA的积累和cGAS-STING途径的异常激活，随后引发自身免疫性疾病如Aicardi-Goutières综合征（AGS）或冻疮性红斑狼疮和系统性红斑狼疮（SLE）。此外，各种细胞损伤引起的线粒体DNA应激也通过触发cGAS活性促进炎症反应。cGAS在先天免疫和自身炎症反应中的重要作用支持cGAS作为cGAS活性异常相关疾病的潜在药物靶点。

近年来，人们致力于开发强效和特异性cGAS抑制剂，靶向cGAS活性位点的多种化学支架的cGAS抑制剂已通过高通量筛选试验发现，并通过药物化学进行了优化。与传统的蛋白质配体结合口袋不同，蛋白质-DNA界面的溶剂暴露、高正电荷和平坦的特性使开发具有类药物性质的小分子抑制剂具有挑战性。大环肽已被证明是调节蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs，开发小分子抑制剂的具有挑战性的界面）的有效工具，因为它们具有高效力和选择性，因此大环肽成为调节蛋白质-DNA界面的潜在骨架。

为了从大环肽库中筛选靶向蛋白质-DNA界面的cGAS抑制剂，作者应用了一种基于RNA的荧光生物传感器来检测2'，3'-cGAMP，用于体外筛选cGAS活性抑制剂，并通过细胞实验进一步筛选验证。在体外蛋白水平和细胞水平测定中苗头分子（hits）之间的抑制活性差异可能归因于它们不同的细胞渗透性，作者鉴定出XQ2在细胞测定中具有最佳cGAS抑制活性，并进一步验证了XQ2特异性抑制人源和鼠源细胞中dsDNA诱导的cGAS活化和cGAS-STING信号传导。接下来，作者在体外通过表面等离子体共振（SPR）、微量热泳动（MST）以及荧光偏振（FP）等技术分析表明XQ2与GAS直接结合，并阻断cGAS与DNA的相互作用。值得关注的是他们的数据显示胞内高浓度的ATP/GTP显著促进XQ2与cGAS的结合亲和力（K_d = 4.5 ± 1.6 μM vs K_d = 45.3 ± 26.9 μM），该作用模式与目前报道的cGAS抑制剂活性因胞内ATP/GTP竞争而减弱显然不同。作者进一步结合分子对接及定点突变阐明XQ2与cGAS的潜在结合模式。

 

图1. XQ2与cGAS结合并阻断cGAS-DNA相互作用

DNA诱导的cGAS液液相分离（LLPS）在调节酶活性和先天免疫信号传导中起着至关重要的作用。鉴于XQ2对dsDNA与cGAS结合的抑制作用，作者进一步在体外蛋白水平和细胞水平验证了XQ2以剂量依赖的方式有效抑制DNA诱导的cGAS液液相分离。

 

图2. XQ2抑制DNA诱导的cGAS液液相分离

 

为了评估XQ2B的临床应用价值，作者利用自身免疫性疾病模型——Trex1^-/-小鼠，进一步验证了XQ2B显著抑制了Trex1^-/-小鼠原代巨噬细胞中I型干扰素和促炎细胞因子的表达水平以及Trex1^-/-小鼠的全身炎症，表明XQ2B有效地减轻了Trex1^-/-小鼠的全身炎症，突出了靶向蛋白质-DNA界面的cGAS特异性抑制剂在cGAS相关自身免疫性疾病中的治疗潜力。

 

图3. XQ2B抑制Trex1^-/-小鼠的全身炎症

总之，这项研究通过体外生化实验、分子模拟、细胞实验和动物实验等技术手段，成功鉴定出一类全新作用机制的cGAS环肽类抑制剂，靶向蛋白质-DNA界面，并阻断DNA诱导的cGAS液相缩合和活化。一种优化的类似物XQ2B在体外和体内抑制HSV-1诱导的抗病毒免疫反应，并显著抑制Trex1^-/-小鼠原代巨噬细胞中I型干扰素和促炎细胞因子水平以及Trex1^-/-小鼠的全身炎症。XQ2B作为首例靶向蛋白-DNA界面及液液相分离的特异性cGAS抑制剂，为进一步开发cGAS相关自身免疫性和自身炎症性疾病药物提供新的思路。

北京大学深圳研究生院博士研究生王小权和中山大学博士研究生王尤桥为该论文的并列第一作者，北京大学深圳研究生院全军民教授和中山大学卜宪章教授为该论文的共同通讯作者。为本文做出贡献的作者还有：北京大学深圳研究生院博士研究生曹安琪、罗钦宏博士、李勤凯博士，遵义医科大学陈道远博士，浙江大学博士研究生赵玮琦、许军博士。该研究得到了国家自然科学基金、深圳市科技创新计划项目、深圳基础研究计划项目和广东省基础与应用基础研究基金项目的支持。

 

全文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-41892-5